Từng học tập tại Việt Nam và Châu Âu, bà Tôn Nữ Thị Ninh bắt đầu sự nghiệp với vai trò giảng viên đại học tại Đại học Sorbonne (Paris) và Đại học Sư phạm Sài Gòn/TPHCM. Sau đó bà hoạt động ngoại giao hơn 20 năm, chuyên trách về các vấn đề toàn cầu (hòa bình và an ninh thế giới, các vấn đề về phát triển, môi trường, và nhân quyền) và các tổ chức đa phương (Liên hiệp quốc, Phong trào Không liên kết, Cộng đồng Pháp ngữ, ASEAN). Bà là người khởi xướng và là một trong những người chủ chốt tổ chức một số sự kiện quốc tế của Việt Nam như Hội nghị Thượng đỉnh các Nước có Sử dụng tiếng Pháp năm 1997 tại Hà Nội. Từ 2000-2003, bà làm Đại sứ tại Bỉ, Luxembourg kiêm Trưởng Phái đoàn đại diện bên cạnh Liên Minh Châu u tại Brussels, trước khi đắc cử vào Quốc Hội – Khóa 11 (nhiệm kỳ 2002-2007) với cương vị Phó Chủ nhiệm Ủy ban Đối ngoại, phụ trách mảng quan hệ giữa Việt Nam với các nước Bắc Mỹ và Tây Âu.

Dù trên cương vị là nhà ngoại giao, đại biểu nhân dân, hay nhà hoạt động văn hóa – xã hội – giáo dục và đối ngoại nhân dân như hiện tại, bà Tôn Nữ Thị Ninh luôn phấn đấu vì sự hội nhập và đóng góp hiệu quả hơn của Việt Nam trên trường quốc tế. Bà hiện là thành viên của một số tổ chức và mạng lưới Việt Nam và quốc tế. Ngoài việc gắn bó với các hoạt động hàn gắn vết thương chiến tranh, ví dụ như kết nối với cộng đồng người Việt tại nước ngoài và hậu quả Chất độc Da cam/dioxin (bà từng là Đồng Chủ tịch Nhóm Đối thoại Mỹ – Việt Nam về chất độc Da cam/dioxin 2007-2008), bà còn tích cực hoạt động trong các lĩnh vực phát triển bền vững, bình đẳng giới, sự vươn lên của thanh niên, và thương hiệu quốc gia – với vai trò Chủ tịch Quỹ Hòa bình và Phát triển TPHCM và Chủ tịch Ủy ban Hòa bình TPHCM.
Ngày nay, phát huy bề dày kinh nghiệm trong lĩnh vực hoạt động quốc tế của mình và tiếp tục theo đuổi tâm nguyện nỗ lực vì sự phát triển của Việt Nam, bà thường xuyên được mời phát biểu tại các sự kiện, hội nghị, hội thảo trong nước và quốc tế. Qua những hoạt động tiếp xúc với công chúng, đặc biệt là giới trẻ, phụ nữ và giới truyền thông, bà được xem như một trong những nhân vật có tiếng nói nhất định với xã hội Việt Nam. Quyển sách của bà “Tư duy và Chia sẻ” đã được tái bản lần thứ tám.

Từ cuối năm 2022, bà khởi xướng sáng kiến Diễn đàn Việt Nam: Thời khắc Việt, sẽ được Quỹ HBPT TPHCM cùng các đối tác tổ chức vào 16-17.08.2024.

Bà Tôn Nữ Thị Ninh đã được Chính phủ Việt Nam trao tặng Huân chương Lao Động Hạng Nhất (2008), Chính phủ Pháp trao tặng Huân chương Bắc Đẩu Bội Tinh (Bậc Sĩ quan – 1998 và Bậc Chỉ huy – 2012) và Chính phủ Bỉ trao tặng Huân chương Leopold II (2003). Bà cũng được Học viện Công nghệ Hoàng gia Melbourne (Đại học RMIT) trao bằng Tiến sĩ Danh dự về Khoa học Xã hội (2017).